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Base taxonômica e enzimática do consórcio microbiano celulolítico KKU

Jul 13, 2023Jul 13, 2023

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 2968 (2023) Citar este artigo

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A biomassa lignocelulósica é um substrato promissor para a produção de biogás. No entanto, a sua estrutura recalcitrante limita a eficiência da conversão. Este estudo tem como objetivo desenhar um consórcio microbiano (MC) capaz de produzir a enzima celulolítica e explorar os aspectos taxonômicos e genéticos da degradação da lignocelulose. Uma gama diversificada de bactérias lignocelulolíticas e enzimas degradantes de vários habitats foram enriquecidas para um KKU-MC1 conhecido. Descobriu-se que o KKU-MC1 é abundante em Bacteroidetes (51%), Proteobacteria (29%), Firmicutes (10%) e outros filos (8% desconhecidos, 0,4% não classificados, 0,6% archaea e os restantes 1% outros bactérias com baixa predominância). A anotação da enzima ativa em carboidratos (CAZyme) revelou que os gêneros Bacteroides, Ruminiclostridium, Enterococcus e Parabacteroides codificavam um conjunto diversificado de enzimas de degradação de celulose e hemicelulose. Além disso, as famílias de genes associadas à desconstrução da lignina foram mais abundantes nos gêneros Pseudomonas. Posteriormente, os efeitos do MC na produção de metano a partir de diversas biomassas foram estudados de duas formas: bioaumento e pré-hidrólise. O rendimento de metano (MY) do bagaço de mandioca pré-hidrólise (CB), capim Napier (NG) e bagaço de cana-de-açúcar (SB) com KKU-MC1 por 5 dias melhorou em 38-56% em comparação com substratos não pré-hidrólise, enquanto MY de A torta de filtro pré-hidrolisada (FC) por 15 dias melhorou 56% em comparação com a FC crua. O MY de CB, NG e SB (a 4% de concentração inicial de sólidos voláteis (IVC)) com aumento de KKU-MC1 melhorou em 29-42% em comparação com o tratamento sem aumento. A FC (1% IVC) teve MY 17% maior do que o tratamento sem aumento. Essas descobertas demonstraram que o KKU-MC1 liberou a enzima celulolítica capaz de decompor diversas biomassas lignocelulósicas, resultando no aumento da produção de biogás.

A produção de biogás a partir de resíduos orgânicos através da digestão anaeróbica (AD) tem atraído interesse mundial nos últimos anos. Esta tecnologia poderá satisfazer a crescente procura de energia e resolver o problema da poluição ambiental1. A matéria-prima utilizada para a fermentação do biogás é abundante; biomassa lignocelulósica, como bagaço de cana (SB) e torta de filtro (FC) das indústrias açucareiras, também capim Napier (NG), bagaço de mandioca (CB) e alguns tipos de resíduos industriais, são os mais comuns e de fácil acesso. No entanto, a utilização desta biomassa lignocelulósica para bioconversão é um desafio devido à natureza altamente recalcitrante da parede celular vegetal, que compreende microfibras de celulose ligadas a redes de hemicelulose e protegidas por lignina. Além disso, a baixa taxa de hidrólise da biomassa lignocelulósica faz com que o processo de degradação diminua, reduzindo a eficiência da produção de metano. Para aumentar a produção de biogás a partir da biomassa lignocelulósica, é necessário um método de pré-tratamento antes do processamento adicional2. Os métodos de pré-tratamento utilizados podem ser classificados em físicos, químicos e biológicos3. Os pré-tratamentos físicos e químicos podem perturbar a estrutura da lignocelulose num espaço de tempo muito curto, aumentando assim a sua biodegradabilidade. Porém, esses métodos aumentam o custo do processo e geram compostos tóxicos ou inibidores no meio ambiente4. Além disso, são necessários tratamentos ácidos ou alcalinos para neutralização após o pré-tratamento, complicando o processo.

O pré-tratamento biológico, que utiliza enzimas ou microrganismos para preparar a biomassa de lignocelulose para a produção de biogás, pode ser demorado em comparação com os pré-tratamentos físicos e químicos. No entanto, estas tecnologias são promissoras porque são amigas do ambiente e económicas4. No entanto, vários factores devem ser cuidadosamente controlados para manter a actividade enzimática estável ou persistente, tais como o tipo de substrato, tempo de pré-tratamento, pH e temperatura. Segundo Parawira, o uso de enzimas livres pode ser menos eficiente e eficaz do que o cultivo de microrganismos que produzem compostos degradadores de lignocelulose estáveis ​​e persistentes5. Por outro lado, a utilização de uma mistura de vários microrganismos isolados é mais eficaz do que a utilização de estirpes únicas devido à natureza complexa da lignocelulose6. O consórcio microbiano (MC) pode ser isolado de vários nichos ecológicos, incluindo solo composto florestal7, habitats compostos8, composto SB9 e compostagem sob AD10. Vários estudos utilizaram MC com sucesso para melhorar a biodegradação da biomassa lignocelulósica e aumentar a produção de biogás. Por exemplo, Wongwilaiwalin et al. descobriram que o NG tratado com MC (criado a partir de culturas de sementes colhidas de composto de bagaço degradado) por 7 dias aumentou o rendimento de metano (MY) em 37% em comparação com o NG11 não tratado. Além disso, o MC enriquecido com composto, lixo vegetal e resíduos animais e agrícolas aumentou a produção de metano do NG12.

 0.05) is shown in Supplementary Table S1. The quadratic and cubic model was chosen as the most effective one for explaining the experimental data (Table S1). The quadratic and cubic model obtained from the mixture design with D-optimal and the analysis of variance (ANOVA) for this model is presented in Supplementary Table S2. To validate the model, an increase in the proportions of SGS resulted in increased FPase activity, while TI does not affect the FPase activity (supplementary Fig.S1a). The avicelase and CMCase may be changes in activities when adjusted the proportion of SGS, which amount should be in the range of 2.0–2.5 mL (supplementary Fig. S1b,c). Additionally, xylanase activity and VS removal efficiency has been strongly affected by the amount of TI, with these values rising as the fraction of SGS increases (supplementary Fig. S1d, S1e). In the meantime, the combination of RSG and SGS is unrelated to improving xylanase activity and VS removal efficiency. From the validation of the model, the combination of RSG, SGS, and TI at optimal proportions 1:1:1 was conducted. The calculation of the combination effect from the response of the mixture design is shown in Table 3. In the case of FPase, the combination effect of Runs 1–16 was in the ranges of 0.22 to 2.03. The combination effect greater than 1 indicates that using a combination of RSC, SGS, and TI at a 1:1:1 ratio (Run 11) is a good way to increase FPase activity. In addition, Run 5 showed a relatively high combination effect (1.98). However, the antagonistic effect of 0.22 on FPase was observed in the proportion of RSC and TI at a 1:1 ratio (Run 6). The synergistic effect on CMCase and avicelase activity was observed in all Runs, especially in Runs 4, 10, and 11. However, Runs 6, 8 (CMCase activity), and 8 (avicelase activity) had a combined effect of 0.9–1.0, approximately the same proportion with neither antagonistic nor synergistic effect. Antagonistic effect on xylanase activity, a combination effect of 0.10–0.12 was obtained from the combination in Run 5 and 7. Meanwhile, a synergistic effect on xylanase activity, a combination effect of 3.13, was found at the optimal proportions of microorganism source, i.e., at a 1:1:1 ratio of combination as RSC, SGS, and TI (Run 11). A synergistic effect on VS removal efficiency was also found in Run 11, with a combined effect of 2.43. The results showed that the combined MC of Run 6 antagonizes all enzymes involved in lignocellulose degradation. In contrast, the combination of MC from Run 11 showed a synergistic effect on enzymes involved in lignocellulose degradation and the efficiency of VS removal. Lin et al. stated that sharing and exchanging public goods such as carbohydrates and aromatic monomers is the essence of cellulolytic microbial synergistic interactions25. In our case, the MC1 showed mutualism (+/+), one of the synergistic interactions caused by sharing public goods26,27./p>

 SB > NG > FC, depending on the lignocellulosic content of each substrate. The CB has a lower lignin content (12.61 ± 5.6%) than the NG, and SB (see Table 1), so lignin and hemicellulose are readily degraded, and microbes use cellulose more easily. Meanwhile, the lowest MPR of FC could be due to an imbalance of the carbon-to-nitrogen (C:N) ratio in the AD process. The FC had a relatively low C:N ratio (24:1), around the lowest recommended limit63. Thus, a co-digestion strategy was introduced to balance C:N nutrients to improve this substrate's degradability and energy production./p> 10%, reads containing adaptor sequences, and reads where 40% of the bases had a Q score of 38). Clean reads were assembled using SOAPdenovo83, and reads with the default parameters (k-mer size of 55 and scaftigs less than 500 bp) were kept for further analysis. Genes were predicted using MetaGeneMark from the scaftigs. After dereplication, all unique genes were used to construct the gene catalogue. BLAST was performed against the MicroNR database to generate taxonomy annotation information for the gene catalog. The top 10 taxa, including phylum, class, order, family, and genus, were visually shown using Krona84. The functional annotation databases were used: the KEGG85,86,87, eggNOG (Version: 4.1)88, and CAZymes (Version: 2014.11.25)89. To represent the number of genes coding for lignocellulose degrading enzymes with the most abundant genus found in the KKU-MC1 metagenome. We have used Microsoft Excel 365 to visualize heat maps and Microsoft PowerPoint 365 to visualize pathways./p>